FLASH色谱纯化理论小讲堂：FLASH C18色谱柱使用注意事项

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发布时间：2021-03-16

色谱分类中，固定相极性强于流动相的分离模式被称为正相分离模式，固定相极性弱于流动相的分离模式称为反相分离模式。作为反相色谱固定相中的一种，C18是一种基质（常用基质是硅胶）上键合十八烷基基团的色谱固定相，与昂贵动辄几万的高压C18柱相比，FLASH C18色谱柱有很大的价格优势。尽管C18的价格在FLASH色谱柱中偏高，但由于出色的分离能力等因素，C18的应用范围越来越广泛。本文将介绍FLASH C18色谱柱的使用注意事项、使用维护方法以保持更长使用寿命并获得更佳分离效果。

编者语：FLASH（中低压快速制备液相）色谱纯化是色谱制备纯化中性价比最高、应用范围最广的一种色谱纯化手段。

使用前预平衡

首先，新FLASH C18色谱柱须用甲醇或乙腈试剂低流速冲洗4~6个柱体积，使固定相能充分润湿、让碳链舒展开来以激活分离柱内填料表面键合的官能团，使色谱柱性能达到良好状态。其次，使用甲醇/水（体积比1:1）或乙腈/水（体积比1:1）体系继续对分离柱冲洗2个柱体积。最后，使用即将在下一步Flash制备色谱中采用的起始流动相对分离柱冲洗3~6个柱体积。

编者语：由于早期的C18的键合过程中会有残留的一些键合试剂，因此很多使用者习惯用四氢呋喃等强溶解性溶剂进行冲洗。但现在基本不会有残留，所以是否仍使用四氢呋喃等强溶解性溶剂取决于使用者的个人习惯。注意：考虑到残留的四氢呋喃会让硅胶基质的填料凝固结块，造成柱压升高、效果变差以至无法使用，因此使用四氢呋喃后，一定要用充分的甲醇将四氢呋喃冲洗出来。

使用过程中：水、酸、碱造成的影响

FLASH C18色谱柱水相影响：由于C18柱的固定相疏水性较强，在纯水（或水比例大于95%)环境下，C18官能团非极性排斥会使伸展状态的官能团在排斥力的作用下“倒伏”，使分析物难以与C18官能团接触，保留时间提前，出现肩峰等峰型变差情况，因此，在分离中尽量减少高水相或纯水相的分离时间。

编者语：水作为反相色谱流动相中的弱溶剂，大比例水相是可以增加化合物的保留，所以一般FLASH色谱反相纯化起始都是较大比例水相，这样水相塌陷致使C18柱寿命变短的情况是常见的，使用者只要用纯甲醇长时间过渡既能恢复一定使用效果。

FLASH C18色谱柱酸的影响：由于C18的化学结构是SI-O-C，在强酸条件容易断裂致使C18脱离失去分离效果，所以C18常规要在PH2以上。如果必须用PH2以下的流动相条件，建议用特殊键合工艺的C18，如多键键合C18（多层键合）。

FLASHC18色谱柱碱的影响：高PH条件下会破坏硅胶的SI-O-SI结构，所以通常硅胶基质的C18使用不能超过PH10。如果必须用PH10以上流动相条件，建议选用非硅胶基质的C18。

FLASH C18色谱柱盐的影响：如分离中使用盐成分，需用中等、高水相流动相进行充分的缓冲衔接，注意：不能用高有机相流动相冲洗含盐分的柱子，因为有可能析出盐结晶而堵塞柱子或破坏柱床。

编者语：由于其配比复杂及后处理等因素，酸碱盐在FLASH（中低压快速制备液相）色谱纯化用得不多，一般使用一些易挥发的三氟乙酸、氨水等。酸碱盐会虽对FLASH C18色谱柱寿命有影响，但对于一些特殊样品（如多酸碱性质样品）有很好的分离效果。关于酸碱盐在色谱分离中作用原理，后续有机会将给大家开个单章进行介绍。

使用结束后

在FLASH C18色谱柱使用完成后，需使用纯有机溶剂（乙腈或者甲醇）对色谱柱进行冲洗，保证没有样品残留。如分离中使用盐成分，需先用高水相流动相再使用纯有机溶剂冲洗。

若FLASH C18色谱柱处于长期闲置状态时，要将其彻底冲洗，建议冲洗10CV以上，最后保存在纯有机试剂或高比例的有机试剂溶液中（如90%甲醇水，或者100%乙腈），且需要定期冲洗，防止柱床干涸，密封保存。

编者语：由于是干法装填，一旦FLASH色谱柱柱床内部的溶剂干涸，势必会造成柱床塌陷。

当C18被样品污染，柱压升高等极端情况的冲洗流程

水→乙腈→氯仿（四氢呋喃、异丙醇）→乙腈

编者语：适用于极端情况，如柱压居高不下，柱床颜色冲不下。冲洗原则：1、根据样品选择强溶剂，对残留样品有强洗脱作用的流动相；2、冲洗标准是柱压恢复，柱床颜色恢复正常。