背景介绍

根据流动相和固定相相对极性的不同，液相色谱可分为正相色谱和反相色谱。对于流动相极性大于固定相极性的情形，称为反相色谱。反相色谱因其柱效高、分离能力强、保留机理清楚，目前已成为液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种，适用于各类极性或非极性化合物的分离纯化，如生物碱、糖类、脂肪酸、甾类、核酸、氨基酸、多肽、蛋白质等。在反相色谱中，常用的固定相为硅胶基质上键合各类功能基团，包括 C18、C8、C4、苯基、氰基、氨基等。这些键合相功能基团中最为常用的是 C18，据统计，目前大约 80%以上的反相色谱分离纯
化中采用了C18键合相，因此，C18色谱柱已成为了目前最常用、每个实验室必备的通用型色谱柱。

尽管 C18分离柱具有非常广泛的适用范围，然而，对于某些极性很大或亲水性很强的样品，普通 C18柱在对这类样品进行分离纯化时可能会遇到一些问题。在反相色谱中，常用的洗脱溶剂对于反相样品的洗脱强度可以排序为:水<甲醇<乙腈<乙醇<四氢呋哺<异丙醇。为了使这类样品(强极性或强亲水性)在分离柱上获得较好的保留时间，通常需要使用高比例的水相体系作为流动相。在采用纯的水体系(包括纯水或纯盐溶液)做流动相时，C18 柱的长碳链会选择避开水而互相搅和到一起，导致色谱柱瞬间保留能力下降甚至无保留作用，此种现象称之为疏水坍塌(参见图1左边部分)。这种情况虽然可逆(可用甲醇或乙腈等有机溶剂冲洗)，但是会对色谱柱造成一定的损坏，因此需要尽量避免这种情况的发生。

图1.普通C18色谱柱和C18AQ柱硅胶表面键合相示意图

针对上述情况，色谱填料生产厂家进行了技术改进，通过在硅胶基质表面进行一些修饰，如引入亲水的氰基(参见图1右边部分)，使硅胶表面的亲水性更强，从而防止疏水坍塌现象的发生。此类经过改性的C18柱被命名为 C18AQ柱，即亲水性 C18柱，专门为高水相洗脱条件设计，可以耐受100%水相体系。C18AQ柱已被广泛应用于有机酸、缩氨酸、核苷以及水溶性维生素等强极性化合物的分离纯化。

C18AQ柱在 Flash 制备纯化样品中的一个典型应用是脱盐操作,即除去样品溶剂中的盐或缓冲液组分，以方便样品应用于后续研究中。在本案例中，强极性的亮蓝作为样品在C18AQ柱上进行了分离纯化，使样品的溶剂从缓冲液置换为有机溶剂，从而方便了后续旋蒸等操作，节省了溶剂及操作时间。且样品中的一些杂质被去除，样品纯度得到了提高。

实验部分

图2.样品的化学结构式

本文中所用样品为亮蓝(Briliant BlueFCF)，粗品纯度为86%，其分子结构式如图2所示。取300mg粉末状亮蓝粗品固体，溶于1MNaH₂PO₄:的水溶液中，摇匀使样品完全溶解为澄清透明溶液。利用注射器将样品溶液上样至Flash分离柱上，样品的Flash分离柱脱盐纯化实验参数如表1所示。

表1.Flash制备纯化实验参数设置

结果与结论

首先利用 C18AQ柱对样品进行脱盐及纯化实验，我们设置了台阶梯度，维持纯水体系作为流动相运行了10个柱体积(CV)，观察色谱图(如图3所示)可知，在纯水作为流动相时样品被完全保留在C18AQ柱上。接下来将流动相中的甲醇直接提高至100%，维持此梯度运行7.5个柱体积，样品在约11.5至13.5个柱体积时被洗脱下来。收集组分中，样品溶液已从NaH₂PO₄缓冲液置换为甲醇，相对于高比例的水溶液，显然甲醇更易于在后续的旋蒸处理中被除去，从而获得可用于下一步研究的目标产物。

图3.样品在C18AQ柱上的Flash纯化色谱图

为了比较 C18AQ柱与普通 C18柱对强极性样品保留行为的不同，我们进行了平行对比试验。由于普通 C18柱一般最高耐受的水相比例为90%左右，因此起始梯度设置为10%甲醇/90%水。样品在普通 C18柱上的 Flash纯化色谱图如图4所示。分析图4可知，由于高比例水相造成的固定相疏水坍塌，样品在普通C18柱上基本没有保留，直接被流动相洗脱下来，因此无法完成脱盐或分离纯化的操作。

图4.样品在普通C18柱上的Flash纯化色谱图

与线性梯度相比，台阶梯度可以带来以下好处:
         1.节省分离纯化所消耗的溶剂和运行时间;
         2.目标产物的洗脱峰呈现一窄峰，降低了收集组分的体积，从而方便了后续的旋蒸处理，节省时间;

3.收集的目标产物溶于甲醇中，溶剂易于被蒸发，从而节省了产物干燥处理的时间。