背景介绍

多肽是由氨基酸组成的化合物，每一条多肽因组成其序列的氨基酸残基种类和排列顺序不同,有着独特的物理和化学性质。随着固相化学合成法的发展，各种活性多肽的化学合成有了很大的进展，但是固相合成法得到的多肽一般成分比较复杂，最终产物必须经过可靠的分离手段进行纯化。

常用的多肽分离纯化方法包括离子交换色谱法(IEC)和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)等，这些方法存在样品载量低、分离介质价格昂贵、分离设备复杂且成本高品等缺点。对于小分子多肽(分子量低于1kD)的快速制备纯化，三秦科技在之前已发布过成功的应用案例，利用 SepaFlash 反相 C18分离柱对胸腺五肽样品进行了快速分离纯化，获得了满足需求的目标产物。

常见的组成多肽的氨基酸有 20种，根据其极性和酸碱性可以分为以下几组:非极性(疏水)、极性(不带电荷)、酸性以及碱性(参见图1)。在一条多肽序列中，如果组成该多肽的氨基酸大多为极性氨基酸(图1中粉红色标出部分)，如半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等，那么该多肽可能具有较强的极性，易溶于水。在对该类强极性多肽样品的反相色谱制备纯化过程中，若采用普通的C18分离柱，将会发生疏水坍塌现象(具体请参见三泰科技之前发布的应用案例--《疏水坍塌与 AQ反相色谱柱的应用》)。而改良后的 C18AQ柱可以很好的适用于强极性或强亲水性样品的分离纯化，在本案例中，利用某强极性多肽作为样品，在C18AQ柱上进行了分离纯化，获得了可用于下一步研究的目标产物。

实验部分

本文中所用样品为客户实验室提供的分子量1kD的合成多肽，其氨基酸序列中含有多个极性氨基酸残基,因此样品具有很强的极性，粗品纯度约为80%。取 60mg白色粉末状粗品固体，溶于5m纯水中，超声使样品完全溶解为澄清透明溶液。利用注射器将样品溶液上样至Fash分离柱上，样品的Fash 分离纯化实验参数如表1所示。

结果与讨论

为了比较普通C18分离柱与CI8AQ柱对极性多肽样品的分离纯化效果,我们首先利用普通 C18分离柱对样品进行了 Flash 制备纯化实验，分离图谱如图2所示。分析图2可知，由于高比例水相造成的固定相疏水坍塌多肽样品在普通C18柱上基本没有保留，直接被流动相洗脱下来，因此没有得到有效的分离纯化。

图2.样品在普通C18分离柱上的Flash 纯化色谱图

接下来我们利用C18AQ柱对样品进行了Flash 制备纯化，分离图谱如图3所示。分析图3可知，多肽样品在 C18AQ柱上获得了有效地保留，粗品中的杂质也得到了有效地分离。将收集组分进行冻干处理后，经HPLC分析，所得纯化产物的纯度约为98.2%，可以用于下一步的研究开发。

图3，样品在C18AQ分离柱上的Flash纯化色谱图